伯乐(Bio-Rad)的液滴生成油在染料法(EvaGreen/SYBR Green等)和探针法(TaqMan/水解探针)ddPCR实验中有显著区别,主要体现在防止交叉污染的设计上。以下是核心区别:
1. 核心区别:防止交叉污染
探针法专用油(如:Droplet Generation Oil for Probes, 货号 #1863005):
含有表面活性剂抑制剂: 这种油含有特殊添加剂(通常是高分子聚合物),能抑制液滴融合和交叉污染。
作用原理: 探针法反应体系中包含表面活性剂(如Tween 20),用于稳定液滴。在PCR热循环过程中,如果液滴不稳定,表面活性剂可能导致相邻液滴的膜变薄甚至融合,造成不同液滴内的靶标分子发生交叉污染(cross-talk),严重影响定量准确性(特别是低丰度靶标)。
目的: 专用油中的抑制剂能有效中和或阻断表面活性剂的这种作用,在高温循环下保持液滴的完整性和独立性,防止融合。
染料法专用油(如:Droplet Generation Oil for EvaGreen, 货号 #1864006):
不含表面活性剂抑制剂: 标准的惰性矿物油混合物。
原因: 染料法(如使用EvaGreen)的反应体系中通常不添加表面活性剂(或含量极低)。EvaGreen等染料本身对液滴膜的稳定性影响较小。因此,在热循环过程中,液滴融合的风险远低于探针法。
目的: 主要作用是作为液滴生成的载体,提供水油不相溶的环境。
2. 成分差异
探针法油: 基础油 + 防止液滴融合的添加剂。
染料法油: 基础油(通常就是精制的矿物油或硅油混合物),不含上述特殊添加剂。
3. 为什么不能混用?
用染料法油做探针法:
灾难性后果! 缺乏抑制剂的保护,反应体系中的表面活性剂会在热循环过程中导致液滴大量融合。
结果:产生大量“假阳性”信号(融合液滴包含来自多个原始液滴的靶标),严重高估阳性液滴数和靶标浓度,定量结果完全不可信。
用探针法油做染料法:
可能影响不大,但不推荐: 理论上,探针法油中的抑制剂对无表面活性剂的染料法体系可能没有负面影响,液滴稳定性通常没问题。
潜在问题: 抑制剂成分可能对某些染料(或PCR反应本身)有未知的、微弱的抑制作用,影响扩增效率或荧光信号强度。此外,探针法油通常更贵,不必要地增加成本。
原则: 严格遵循试剂盒或官方推荐使用对应的油。
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