金山科研平台是PacBio代理三代测序 单分子实时测序技术

一、PacBio测序

01.技术发展

2011年，Pacific Biosciences推出PacBio RS测序仪，实现长读长测序，但误差率较高。之后陆续推出Sequel System、Sequel II System、Sequel IIe System，数据输出逐步提升。2022年推出的Revio系统，测序通量大幅提高，工作流程简化，准确性提升。

02.技术原理

基于SMRT（Single Molecule, Real-Time）技术，利用SMRT细胞（含数百万个纳米级孔，即零模波导ZMWs）进行高保真DNA测序。DNA聚合酶在ZMWs中复制环形化DNA片段，添加荧光标记核苷酸时会发出荧光，用于碱基识别。通过多次复制同一DNA片段，生成一致序列（CCS），提高测序准确性。

PacBio测序方法：不同的仪器采用相同的化学原理，基于一种名为SMRT（单分子实时）细胞的硅芯片。该芯片拥有数百万个用于测序反应的小孔（A）。在每个小孔中，固定有单个DNA分子，注入荧光标记的核苷酸后，该DNA分子即可进行复制（B）。荧光信号被记录下来并用于碱基识别（C）。

03.文库制备

DNA文库制备包括DNA片段化（片段大小通常15 - 20kb，可根据应用调整）和连接发夹适配器形成SMRTbell模板，确保每条DNA片段的正义链和反义链都能被测序，提高CCS生成准确性。RNA文库制备采用Iso - Seq方法，无需cDNA片段化和转录本组装，可分析全长转录本，还可与MAS - Seq串联方法结合提高转录本异构体测序通量。

PacBio 文库制备流程：以基因组 DNA 为起始材料，文库制备过程的第一步是 DNA 片段化。然后，将 DNA 片段进行发夹式连接，以获得适合聚合酶结合和测序的 SMRTbell 文库（A）。全长 mRNA 也可用作输入样本。实际上，先将 mRNA 进行逆转录、扩增，再进行发夹式连接。得到的 SMRTbell 文库即可用于测序（B）。

04.优势与局限

优势

平均读长15 - 20kp；

测序准确性高（可达99.9%）；

可分析复杂基因组区域；

能直接检测甲基化；

罕见突变检测/高复杂区域解析/小样本精准测序研究场景中更具优势。

局限

与其他三代测序相比，读长较短，平台成本较高，生信分析能力要求更高。